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多角度激光散射儀（Multi-Angle Light Scattering, MALS）是一種通過(guò)測(cè)量樣品分子或顆粒在不同角度的散射光強(qiáng)度，來(lái)分析其分子量、分子尺寸（如回轉(zhuǎn)半徑 Rg）及分子構(gòu)象的高精度儀器，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、聚合物、膠體等納米至微米級(jí)顆粒的表征。以下是其基本操作步驟及關(guān)鍵注意事項(xiàng)：

一、操作前準(zhǔn)備
1.儀器檢查
激光源：確認(rèn)激光器（通常為氦-氖激光，波長(zhǎng)632.8nm或固態(tài)激光）已預(yù)熱30分鐘以上，確保輸出功率穩(wěn)定（如≥50mW）。
檢測(cè)器陣列：檢查光電二極管檢測(cè)器（通常覆蓋15°-165°范圍）是否清潔，無(wú)灰塵或劃痕。
流路系統(tǒng)：若為聯(lián)用儀器（如SEC-MALS），檢查色譜柱、泵、進(jìn)樣閥及連接管路是否無(wú)泄漏，流動(dòng)相（如緩沖液或有機(jī)溶劑）需脫氣處理。
2.樣品準(zhǔn)備
濃度控制：
蛋白質(zhì)樣品：濃度通常為0.1-5 mg/mL（避免自聚集或內(nèi)濾效應(yīng)）。
聚合物樣品：濃度需根據(jù)分子量調(diào)整（如Mw<100 kDa時(shí)可用1 mg/mL，Mw>1 MDa時(shí)需稀釋至0.1 mg/mL）。
過(guò)濾處理：使用0.1 μm或0.22 μm濾膜過(guò)濾樣品，去除顆粒雜質(zhì)（避免堵塞檢測(cè)器或干擾散射信號(hào)）。
溶劑匹配：確保樣品溶劑與流動(dòng)相一致（如PBS緩沖液或THF有機(jī)溶劑），避免折射率差異導(dǎo)致信號(hào)偏差。
3.軟件與參數(shù)設(shè)置
儀器控制軟件：?jiǎn)��?dòng)MALS數(shù)據(jù)采集軟件（如ASTRA、WyattQELS），設(shè)置以下參數(shù)：
激光波長(zhǎng)：根據(jù)儀器型號(hào)選擇（如632.8nm或488nm）。
檢測(cè)角度范圍：通常為15°-165°，角度間隔5°-10°。
溫度控制：若需恒溫測(cè)量，設(shè)置樣品池溫度（如25℃±0.1℃）。
數(shù)據(jù)采集時(shí)間：根據(jù)樣品流速調(diào)整（如SEC-MALS中流速0.5-1 mL/min時(shí)，采集時(shí)間≥10分鐘）。
二、儀器校準(zhǔn)
1.基線校準(zhǔn)
注入純?nèi)軇�（如去離子水或空白緩沖液），采集散射信號(hào)作為基線，確保各角度檢測(cè)器信號(hào)穩(wěn)定且無(wú)漂移。
2.光學(xué)校準(zhǔn)
激光對(duì)齊：通過(guò)軟件調(diào)整激光光路，使光斑中心對(duì)準(zhǔn)檢測(cè)器陣列中心（避免信號(hào)截?cái)啵��?br /> 角度校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)樣品（如聚苯乙烯乳膠球，已知 Rg 和分子量）驗(yàn)證檢測(cè)器角度準(zhǔn)確性，必要時(shí)進(jìn)行角度修正。
3.濃度校準(zhǔn)（可選）
若需**分子量測(cè)定，需聯(lián)用濃度檢測(cè)器（如RI或UV）：
RI檢測(cè)器：注入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品（如葡萄糖），建立濃度-RI信號(hào)曲線。
UV檢測(cè)器：使用蛋白質(zhì)在280nm的消光系數(shù)（ε）或聚合物在特定波長(zhǎng)的摩爾吸光系數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)。
三、樣品測(cè)量
1.進(jìn)樣
手動(dòng)進(jìn)樣：使用微量注射器（如100 μL）將樣品注入樣品池，避免氣泡產(chǎn)生。
自動(dòng)進(jìn)樣：若聯(lián)用SEC系統(tǒng)，設(shè)置進(jìn)樣體積（如50-100 μL）并啟動(dòng)泵，樣品經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入MALS檢測(cè)器。
2.數(shù)據(jù)采集
啟動(dòng)數(shù)據(jù)采集，軟件實(shí)時(shí)顯示各角度散射光強(qiáng)度（I(θ)）隨時(shí)間或保留時(shí)間的變化曲線。
觀察信號(hào)穩(wěn)定性，確保無(wú)異常波動(dòng)（如氣泡或顆粒堵塞導(dǎo)致的尖峰）。
3.關(guān)鍵參數(shù)記錄
散射光強(qiáng)：記錄各角度的 I(θ) 值，用于后續(xù)構(gòu)象分析（如 Rg 計(jì)算）。
保留時(shí)間（SEC-MALS）：若聯(lián)用色譜系統(tǒng)，記錄樣品峰的保留時(shí)間，輔助分子量分布分析。
四、數(shù)據(jù)分析
1.構(gòu)象分析（Zimm圖法）
根據(jù)Debye散射理論，繪制 Kc/Rθ 對(duì) sin²(θ/2) 的Zimm圖（K 為光學(xué)常數(shù)，c 為濃度，Rθ 為瑞利比）。
線性擬合外推至 θ=0° 和 c=0，得到分子量 Mw 和回轉(zhuǎn)半徑 Rg。
2.分子量計(jì)算
**分子量：通過(guò)聯(lián)用濃度檢測(cè)器（RI/UV），結(jié)合散射光強(qiáng)和濃度數(shù)據(jù)，利用軟件（如ASTRA）自動(dòng)計(jì)算 Mw。
相對(duì)分子量：若未聯(lián)用濃度檢測(cè)器，可通過(guò)標(biāo)記物（如BSA）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量。
3.構(gòu)象判斷
根據(jù) Rg 與分子量的關(guān)系（Rg ∝ Mw^ν）判斷分子構(gòu)象：
ν=0.33：剛性球狀構(gòu)象（如蛋白質(zhì)折疊態(tài)）。
ν=0.5-0.6：無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象（如未折疊蛋白質(zhì)或柔性聚合物）。
ν=0.588：理想鏈構(gòu)象（如θ條件下的聚合物）。
五、操作后處理
1.儀器清洗
注入純?nèi)軇�（如去離子水或有機(jī)溶劑）沖洗流路和樣品池，避免樣品殘留導(dǎo)致交叉污染。
關(guān)閉激光器，待冷卻后關(guān)閉儀器電源。
2.數(shù)據(jù)存儲(chǔ)與導(dǎo)出
保存原始數(shù)據(jù)文件（如.asc或.dat格式）及分析報(bào)告（含 Mw、Rg、構(gòu)象參數(shù)等）。
導(dǎo)出圖像（如Zimm圖、散射光強(qiáng)曲線）用于論文或報(bào)告。
3.維護(hù)與記錄
記錄儀器使用日志（如操作時(shí)間、樣品名稱(chēng)、異常現(xiàn)象等），便于后續(xù)故障排查。
定期更換濾膜、密封圈等耗材，確保儀器長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
六、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
1.避免光損傷：激光對(duì)生物樣品（如蛋白質(zhì)）可能造成光損傷，需控制曝光時(shí)間（如單次測(cè)量<5分鐘）或使用低功率激光。
2.防止氣泡干擾：進(jìn)樣時(shí)需緩慢注射，避免氣泡進(jìn)入樣品池導(dǎo)致信號(hào)噪聲。
3.溫度控制：若樣品對(duì)溫度敏感（如DNA），需使用恒溫樣品池并確保溫度均勻性。
4.多角度驗(yàn)證：結(jié)合不同角度的散射數(shù)據(jù)，避免單角度測(cè)量導(dǎo)致的構(gòu)象誤判（如各向異性散射）。

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